Phân tích một số thuốc điều trị COVID-19 bằng LC-MS/MS trong thử nghiệm lâm sàng

Đại dịch Covid-19 đã thúc đẩy việc sử dụng các loại thuốc thay thế để điều trị cho bệnh nhân trên toàn thế giới. Tuy nhiên, việc thiếu kiến thức về nồng độ và dược động học để đề xuất liều lượng phù hợp đang hạn chế quá trình điều trị. Trong khi đó, LC-MS/MS là phương pháp định lượng đáp ứng nhu cầu này vì phương pháp chuẩn bị mẫu đơn giản để cho phép thông lượng mẫu cao đồng thời tách sắc ký nhanh chóng và mạnh mẽ của các loại thuốc điều trị COVID-19.

Năm 2020, Eric Bertrand và cộng sự đã tiến hành định 3 thuốc điều trị COVID-19 gồm Chloroquine, Hydroxychloroquine  và Desethyl cholorquine. Với hệ thống Shimadzu Nexera X2 LCMS 8060. HPLC: Cột Kinetecs C18 (100×2,1 mm; 2,6 µm); Pha động gồm acetonitrile (axit formic 0,1%) và nước (axit formic 0,2%). Tốc độ dòng 0,3 ml/phút. Thể tích tiêm 10 µl. Thời gian 3 phút. Khối phổ: Chế độ ion hóa điện tử ESI, positve (+), MRM. Qui trình xử lý mẫu: Thêm 50 μL máu có Heparin vào ống Eppendorf; Thêm 150 μL dung dịch, lắc xoáy
30 giây. Để yên 5 phút ở nhiệt độ phòng, lắc xoáy 15 giây và ly tâm 10.900 vòng/phút; Cho 100 μL dịch chiết và 400 μL nước chưa axit formic 0,2% vào vial, lắc xoáy 15 giây . Tiêm 10 μL dịch vào LC-MS/MS.

Trong cùng năm 2020, ALSACHIM PHÂN TÍCH 9 THUỐC BẰNG LC-MS/MS sử dụng cho hơn 50% thử nghiệm lâm sàng trên toàn thế giới đối với bệnh nhân COVID-19. Gồm Favipiravir: thuốc kháng virut; GS 441524: chất chuyển hóa Remdesivir; Remdesivir: thuốc kháng virut; Hydroxycholoroquine; Desethyl cholorquine; Chloroquine; Azithromycin: kháng sinh; Ritonavir và Lopinavir điều trị HIV/AIDS. Hệ thống Shimadzu Nexera X2 LCMS 8050. HPLC: Cột C18 (50×2,1 mm; 5 µm); Pha động gồm methanol và nước có axit formic 0,1%. Tốc độ dòng 0,5 ml/phút. Thể tích tiêm 1 µl. Thời gian 6 phút. Khối phổ: Chế độ ion hóa điện tử ESI, positve (+), MRM. Quy trình xử lý mẫu: Lấy 50 µl của huyết tương vào ống 1,5 ml; Thêm 200 µl MeOH trong chất chuẩn nội; Lắc xoáy 1 phút; Ly tâm 15000 vòng/phút trong 7 phút; Pha loãng lớp dịch chiết bằng 100 µl nước (axit formic 01,%). Bảng 1 phân mảnh ion theo chế độ MRM của phương pháp LC-MS/MS.

Hình 1. Khoảng nồng độ của các thuốc phân tích

  Năm 2020, WATERS PHÂN TÍCH 9 THUỐC BẰNG LC-MS/MS có sự điều chỉnh thay Azithromycin bằng Dexamethasone điều trị bệnh nhân COVID-19, bao gồm Favipiravir; Remdesivir (GS-5734); GS 441524; Chloroquine; Hydroxycholoroquine; Desethyl cholorquine; Lopinavir; Ritonavir; Dexamethasone: nhóm corticosteroid. Hệ thống Acquity UPLC i-class/Xevo TQ-S micro IVD System. HPLC: Cortecs (50x 2,1 mm; 2,7) ; Pha động gồm methanol và đệm amoni format 10mM và axit formic 0,2%. Thể tích tiêm 15 µl. Thời gian 3,3 phút. Khối phổ: Chế độ ion hóa điện tử ESI, positve (+), MRM. Quy trình xử lý mẫu: Lấy 50 µl của huyết tương cùng chuẩn nội được kết tủa bởi 100 µl methanol- dung dịch ZnSO₄ (30:70); Khuấy trộn và ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút; Pha loãng 50 µl dịch chiết bằng 100 µl đệm amoni format 10mM và axit formic 0,2%.

Năm 2020, Jean-Claude Alvarez và cộng sự tiến hành ĐỊNH LƯỢNG REMDESIVIR VÀ GS 441524 TRÊN BỆNH NHÂN COVID-19 bằng Hệ thống TSQ Endura triple-quadrupole mass spectrometer (ThermoFisher). Qui trình xử lý mẫu: 50 µL of huyết tương được kết tủa với 75 µL methanol chứa nội chuẩn và 5 µL dung dịch ZnSO₄ 1 M; Lắc xoáy 15 giây, mẫu được để yên ở +4 °C for 10 phút, và ly tâm 18000 vòng/phút trong 10  phút; Dung dịch chiết chuyển vào vial và tiêm 20 µL vào hệ thống LC-MS/MS. Từ đó, Dược động học Remdesivir: Nồng độ trong huyết tương đạt 150 μg/L sau 2 giờ tiêm. Sau 10 giờ, nồng độ về LLOQ; Thời gian bán thải là 0,8 giờ, C₀ là 800 μg/L trên bệnh nhân. Chất chuyển hóa GS-441524: xuất hiện sau 2 giờ ở ngưỡng 300 μg/L and giảm chậm về 120 μg/L sau 24 giờ; Thời gian bán thải là 12 giờ.

Năm 2021, Alana định lượng molnupiravir và chất chuyển hóa ß-d-n4-hydroxycytidine. Cơ chế của Remdesivir làm chậm quá trình nhân bản của virus, thì Molnupiravir trực tiếp làm vô hiệu hóa quá trình nhân bản. Qui trình xử lý mẫu: Chất phân tích được chiết xuất từ nền bằng cách kết tủa protein sử dụng acetonitril; làm khô, pha loãng bằng methanol và tiêm vào cột sắc ký. Thiết bị: Hệ thống LC-MS/MS, cột  sắc ký Atlantis C18. Chế độ ion hóa điện tử ESI, negative (-), MRM.  Pha động gồm acetonitrile (amoni acetat 1mM) và nước (amoni acetat 1mM, pH 4,3). Ở thời điểm hiện tại, cả Molnupiravir và Paxlovid đều được kỳ vọng có được hiệu lực cao trước biến thể Omicron. Đó là bởi hai loại thuốc kháng này không nhằm ức chế protein gai (spike protein), nơi tập trung các đột biến nguy hiểm nhất của Omicron. Hai mẫu thuốc này có cơ chế hoạt động khác biệt nhằm ngăn chặn virus lây nhiễm.

Như vậy, phân tích thuốc điều trị COVID-19 có quy trình xử lý mẫu đơn giản, nhiều nghiên cứu tiến hành trên hệ thống khối phổ tứ cực chập ba (triple-quadrupole mass spectrometry). Do đó, LC-MS/MS không chỉ để định lượng các thuốc điều trị COVID-19 mà còn đóng nhiều vai trò quan trọng trong tương lai!

Đào Thị Cẩm Minh

Tài liệu tham khảo:

1. Eric Bertrand, 2020, Determination of Chloroquine, Hydroxychloroquine and its Metabolite Desethyl Hydroxychloroquine in Plasma Samples by LC-MS/MS on a Kinetex® 2.6 µm F5 100 x 2.1 mm Core-Shell LC Column, Application of Phenomenex, TN73940420_W
2. Alsachim (A shimazdu group company), 2020, Method for multiple COVID-19 drugs analysis by LC-MS/MS, Application data sheet number 4.
3. Dominic Foley, Lisa J. Calton, David Morrissey, 8/2020, Comprehending COVID-19: LC-MS/MS Analysis of Small Molecule Anti-Viral and Anti-Inflammatory Drugs in Plasma in Clinical Research, Application Note. (https://www.waters.com/waters/en_US/Xevo-TQ-S-micro-Triple-Quadrupole-Mass-spectrometry/nav.htm?locale=en_US&cid=134798856).
4. Jean-Claude Alvarez, Pierre Moine, Isabelle Etting, Djillali Annane, Islam Amine Larabi, (2020), Quantification of plasma remdesivir and its metabolite GS-441524 using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Application to a Covid-19 treated patient, Clinical Chemistry and Laboratory Medicine.
5. Alieu Amara, Sujan Dilly Penchala, Laura Else, Colin Hale, Richard FitzGerald, Lauren Walker, Rebecca Lyons, Tom Fletcher, Saye Khoo, (2021), The development and validation of a novel LC-MS/MS method for the simultaneous quantification of Molnupiravir and its metabolite ß-d-N4-hydroxycytidine in human plasma and saliva, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 206, 114356.