Các phương pháp và xu hướng phân tích Riboflavin (vitamin B2) trong mẫu thực phẩm, sinh học và dược phẩm

Vai trò của riboflavin trong lĩnh vực thực phẩm, sinh học và dược phẩm được đánh giá ngày càng cao, việc xác định chính xác hàm lượng của nó có ý nghĩa to lớn trong dinh dưỡng, chẩn đoán hoặc điều trị các bệnh liên quan, nghiên cứu tác dụng dược lý của riboflavin và đảm bảo chất lượng thực phẩm/thuốc.

Riboflavin, hay còn gọi là vitamin B2, có vai trò quan trọng trong việc duy trì sức khỏe của sinh vật, vì nó là tiền chất duy nhất để tạo ra coenzyme flavin adenine dinucleotide (FAD) và flavin mononucleotide (FMN), trong khi FAD và FMN tham gia vào nhiều phản ứng enzym và đóng vai trò chuyển hóa chính trong các phản ứng oxy hóa khử sinh học qua trung gian vận chuyển điện tử.

Riboflavin không được tổng hợp trong cơ thể con người và kho dự trữ của nó bị hạn chế trong cơ thể sống. Sự thiếu hụt Riboflavin có thể dẫn đến rối loạn chuyển hóa, chậm phát triển ở trẻ em, tổn thương da/niêm mạc, thậm chí là ung thư và các bệnh khác, trong khi hấp thụ quá nhiều Riboflavin có thể gây ra tổn thương do quá trình oxy hóa nhẹ của các mô tiếp xúc, suy thoái DNA và gia tăng sự hình thành các lipid peroxides do Riboflavin nhạy cảm với ánh sáng. Do đó, việc định lượng Riboflavin trong sinh vật có thể hỗ trợ cho quá trình chẩn đoán. Trong đảm bảo chất lượng thực phẩm, việc giảm hàm lượng Riboflavin được coi là dấu hiệu hư hỏng của một số thực phẩm do chất cảm quang của Riboflavin. Trong lĩnh vực dược phẩm, với sự nghiên cứu chuyên sâu về tác dụng dược lý của Riboflavin trong những năm gần đây, đây được xem là một loại thuốc tiềm năng để tiêu diệt các khối u trong liệu pháp quang động, điều trị các bệnh tim mạch/mạch máu não và kháng khuẩn. Do đó, việc xây dựng các phương pháp phát hiện riboflavin chính xác có ý nghĩa quan trọng trong hướng dẫn chuyển hóa dinh dưỡng, chẩn đoán lâm sàng và điều trị các bệnh liên quan, nghiên cứu tác dụng dược lý và bảo đảm chất lượng thuốc và thực phẩm.

Trong những năm gần đây, đã có nhiều báo cáo về các phương pháp phát hiện tiên tiến tích hợp với các vật liệu chức năng mới để phân tích riboflavin. Sau đây là một số phương pháp phân tích riboflavin trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm và sinh học, bao gồm MS, huỳnh quang, điện hóa và các kỹ thuật phát hiện khác với những quan điểm đề xuất và xu hướng phát hiện riboflavin trong tương lai.

1. Tiền xử lý mẫu

Tiền xử lý mẫu là quy trình làm sạch trước khi phân tích để giảm làm bẩn thiết bị, nhiễu tín hiệu và hiệu ứng nền của các mẫu phức tạp. Phương pháp tiền xử lý mẫu thích hợp sẽ giúp cải thiện hiệu suất phân tích riboflavin, tuy nhiên lại có nhiều thách thức do: riboflavin không bền và dễ bị phân hủy trong dung dịch kiềm hoặc dưới ánh sáng; Giống như hầu hết các họ vitamin B, riboflavin là vitamin tan trong nước, có tính phân cực mạnh; Nồng độ tự nhiên của riboflavin rất thấp, thường xuất hiện ở dạng FAD (FMN) và cùng tồn tại với nhiều chất cấu trúc tương tự; Có nhiều chất nền phức tạp khác nhau trong các mẫu thực phẩm, dược phẩm và sinh học, như protein, lipid và polysaccharid, cũng như các vitamers, dễ dàng liên kết với riboflavin và khó chiết xuất.

* Chiết thô: Các mẫu riboflavin cần kiểm tra thường là các sản phẩm sữa tươi, đồ uống dinh dưỡng, dịch cơ thể hoặc các mẫu rắn khác như viên nén, ngũ cốc. Riboflavin tự do trong đồ uống và dược phẩm thì cao hơn, việc chiết xuất cũng tương đối dễ dàng hơn vì riboflavin không liên kết chặt chẽ với các hợp chất khác.

Ngoài ra, hơn 90% riboflavin trong thực phẩm ở dạng FAD/FMN và 10% còn lại ở dạng tự do và glycosid/este. Mẫu cần trải qua các bước chiết xuất thô phức tạp như thẩm tách axit, phân giải enzym và kết tủa protein để giải phóng riboflavin liên kết. Nói chung, quá trình làm sạch mẫu gồm nhiều bước phức tạp sẽ làm giảm hiệu suất chiết xuất ở mức độ nhất định và hiệu quả làm sạch mẫu có liên quan đến mức độ liên kết của riboflavin trong mẫu.

* Kỹ thuật tiền xử lý mẫu:

Các bước tinh sạch mẫu thô làm giảm lượng vitamers, protein, lipid, v.v. có thể có, và riboflavin được giải phóng vẫn tồn tại trong môi trường nước. Rất khó để làm giàu và rửa giải loại vitamin phân cực mạnh này thông qua các kỹ thuật chiết xuất bằng dung môi thông thường hoặc tiền xử lý mẫu dựa trên các chất hấp phụ thông thường. Theo đó, các vật liệu chức năng (khung hữu cơ cộng hóa trị, polyme được đánh dấu phân tử, vật liệu dựa trên silicon, vật liệu dựa trên carbon, v.v.) được kết hợp với các kỹ thuật tiền xử lý mẫu khác nhau như chiết pha rắn (SPE), chiết pha rắn từ tính (MSPE), chiết xuất pha rắn phân tán (d-SPE) được phát triển để làm giàu thêm và chiết xuất riboflavin.

2. Sắc ký

Mặc dù các bước tinh sạch mẫu thô và kỹ thuật tiền xử lý mẫu có thể loại bỏ đáng kể các chất nền, nhưng rất khó tránh khỏi các chất gây nhiễu, đặc biệt là các chất tương tự riboflavin hoặc các vitamin khác. Tách bằng sắc ký là một phương pháp tách cổ điển và phổ biến trong hóa học phân tích, có hiệu quả tách vượt trội trong việc hỗ trợ phát hiện riboflavin thông qua việc kiểm soát các điều kiện sắc ký. Dựa trên tương tác khác nhau của các chất trên pha tĩnh và pha động, riboflavin được cân bằng giữa hai pha và tách khỏi các tạp.

– Sắc ký lỏng: Đại diện quan trọng của phân tách sắc ký là sắc ký lỏng (LC), thường được sử dụng để tách chất không bay hơi, phân cực cao hoặc không bền nhiệt và hỗ trợ thiết lập một số phương pháp tiêu chuẩn chính để phân tích riboflavin. Theo các điều kiện và yêu cầu khác nhau, LC có thể kết hợp với các thiết bị dò khác chẳng hạn như UV, FD, PAD, DAD và MS, để phát hiện riboflavin với tốc độ, hiệu quả phân tách và độ nhạy cao.

– Điện di mao quản (CE) là một kỹ thuật phân tách có nhiều ưu điểm như tiêu thụ ít mẫu và thuốc thử, dễ tự động hóa, chi phí thấp và thời gian phân tích ngắn.

– Sắc ký lớp mỏng hiệu suất cao (HPTLC) là một phương tiện phân tách tuyệt vời với tính đơn giản, khả năng phát hiện và độ tin cậy cao.

3. Phương pháp phát hiện

3.1. MS

Đầu dò MS có các tính năng thông lượng mẫu cao, hiệu quả phân tích vượt trội, độ nhạy cao và độ chọn lọc tuyệt vời, có thể định lượng mục tiêu bằng cách giám sát đặc biệt nhiều mảnh ion. Vì MS có thể thiết lập phương pháp xác định độ đặc hiệu cho riboflavin theo thông tin cấu trúc phân đoạn của nó từ góc độ chọn lọc của thiết bị, MS có lợi thế đáng kể trong việc định lượng riboflavin ở nồng độ thấp trong các mẫu phức tự nhiên với LODs cực kỳ thấp.

3.2. Phương pháp huỳnh quang

So với các phương pháp phát hiện riboflavin khác, phương pháp huỳnh quang là một công cụ phân tích thuận tiện do đơn giản, nhanh chóng và độ nhạy cao. Quan trọng hơn là, riboflavin có phản ứng huỳnh quang cường độ cao tự nhiên do sự liên hợp p và cộng hưởng của isoalloxazine trong cấu trúc, điều này làm cho việc phát hiện huỳnh quang trở thành một phương pháp phổ biến, thuận tiện và khả thi để phân tích riboflavin, đồng thời thúc đẩy nhà hóa học khám phá các nền tảng cảm biến huỳnh quang đa dạng đối với riboflavin.

3.3. Xét nghiệm miễn dịch

Xét nghiệm miễn dịch là một phương pháp phát hiện dựa trên sự tương tác giữa kháng thể và kháng nguyên, được áp dụng rộng rãi trong lĩnh vực sinh học, dược phẩm và thực phẩm do thông lượng mẫu cao, chi phí tương đối thấp, độ đặc hiệu và độ nhạy cao.

Một este hoạt tính biến đổi carbodiimide được sử dụng để điều chế chất sinh miễn dịch cho riboflavin, đặc hiệu cao ngay cả khi có sự tồn tại của các sản phẩm quang phân riboflavin và các vitamin họ B khác. Tương tự, việc sử dụng D-Ribitol và D-ribitol-5-phosphate làm kháng thể đặc hiệu có thể nhận ra riboflavin và coenzyme của nó (flavin mononucleotide), nhờ đó phương pháp ELISA cạnh tranh gián tiếp có thể phát hiện riboflavin trong thực phẩm và dược phẩm.

Tổng hợp và lược dịch

ThS. DS. Nguyễn Hoài Bảo Châu

Tài liệu tham khảo

1. Tianyu Zhou (2021), Recent analytical methodologies and analytical trends for riboflavin (vitamin B2) analysis in food, biological and pharmaceutical samples, Trends in Analytical Chemistry 143 (2021) 116412